色谱峰值保留时间不稳定怎么办

本文主要介绍在色谱实验过程中经常遇到的保留时间不稳定问题，不同现象的解决方法如下。

一、用的同一台仪器同一根色谱柱同一瓶流动相，保留时间在同一天变化大

1、首先检查泵和混合器。使用秒表和量筒来检测流速，具体方法是设置仪器流速1ml/min，用10ml量筒收集流出液10分钟，应该得到液体约10ml±0.5ml，量筒有误差，使用的试剂与仪器厂家标定泵流速时试剂不一样，最终体积也有些差异，如果超过这个范围，再分开通道检测，以找到流速不正确的原因并排除。

2、检查流动相组成是否变化，可以在流动相中加入跟踪剂来观察基线的变化，例如反相条件UV检测器，在有机相中加入0.1%丙酮，监测254nm下的基线变化。还有一种方法人工配制流动相，然后通过混合器，这时候保留时间稳定了，不再波动，那就是混合器工作不正常，或者混合不均匀，进行排除。

二、保留时间一天之内正常，不同天数之间变化

1、可能是流动相的组成变化引起的。在反相色谱中，保留因子k和流动相中的有机溶剂的体积含量成指数关系，根据经验，如果有机溶剂含量误差在1%，那保留时间的变化在5%-15%之间，大部分变化在10%左右，意味着用称量有机溶剂的方式配置流动相能得到更稳定的保留时间。

2、也可能是流动相的脱气方式导致的。最好的脱气方式是使用真空超声脱气大约1分钟左右，非真空条件下超声脱气5分钟，这样会最大程度的减少溶剂的挥发。还有一种方法是流动相中通过氦气，流动相被氦气平衡后，氦气流立刻关闭，避免氦气带走溶剂蒸汽，而导致溶剂组成改变。

3、流动相的抽滤方式。通常情况下如果我们使用有机溶剂和水相混合流动相时，会先将流动相配置混匀好后，再进行抽滤，这样的好处是流动相混合更均匀，但是对于流动相中沸点较低的部分，在抽滤过程中会损失更大，导致流动相溶剂组成改变，建议有机相和水相分开抽滤，再进行混合，超声脱气。

4、流动相的PH值。检测目标物是离子状态或者离子化的，那么控制流动相的pH就非常重要，就算是0.1单位pH的变化都有可能导致保留时间漂移10%左右，所以准确称量pH值并保证pH仪被很好的校正了，在反相色谱柱中，随着pH值的升高，酸的保留会减少，碱的保留会增加。反相色谱中，分离离子或离子化的样品，保留时间会受到正确缓冲溶液的离子强度的影响，但影响会很小，可以不计，典型状况是缓冲盐的摩尔数改变20%，保留时间的变化是1%，缓冲盐的组成通常是称量的，那么大的误差是不会发生的。

三、保留时间漂移

1、如果使用的是未修饰硅胶柱做正相色谱，平衡是最有可能的原因，使用半饱和流动相改善。反相色谱中，平衡通常会很快，5-10个柱体积的流动相通常就足够平衡了，但不全是如此，典型的就是离子对色谱中，使用离子对试剂平衡色谱柱，由于离子对试剂的浓度在2-5mmol/L甚至更低的浓度，它们要吸附在反相色谱柱填料表面，表面浓度在0.5-2μmol/m2，1根4.6*250mm的色谱柱大约有3g填料，需要2mmol的离子对试剂进行完全的柱平衡，流动相浓度为2mmol时，那需要1L流动相进行平衡，这个虽然是极端条件，但是用几百毫升的流动相去平衡色谱柱也是正常的，因此离子对色谱中，使用了有机溶剂清除了离子对试剂，这样第二天需要更长的时间平衡色谱柱。这两个现象都是流动相中有低浓度的强吸附试剂导致的，这是保留时间漂移最常见的原因。

2、样品中含有强吸附剂，在重复进样中会慢慢累积，从而改变色谱柱的化学性质，如药品的赋形剂。可以通过观察保留时间变化的速率来得知杂质是从流动相中引入还是样品中引入。

3、键合相水解。色谱柱制造商会制定一个pH范围，超出范围可能导致键合相不稳定，但是很多情况下使用者不得不接近这个pH极限。水解还取决于其他因素，如温度，有机溶剂，缓冲盐的浓度和种类，样品的化学性质等，因此水解也可能发生在这个pH范围内。要保存固定相的水解稳定性，最好是在中性pH值（3-5左右）和低温下。等度条件稳定性优于梯度条件，在等度条件下发生水解的过程中，键合相通常会发生自我吸附，并达成一种区域平衡，在使用高浓度的有机溶剂时，在梯度时或者冲洗色谱柱时，这种平衡会被打破，键合相被冲出色谱柱。

4、温度的变化。如果样品是自动分析过夜或者过了周末，那保留时间的漂移可能和实验室的温度变化有关，在很多地方室温的设置在晚上或者周末是不一样的，一般来讲，1℃的变化导致保留时间的漂移大约在1%到2%。

5、反相色谱键合相发生了“相塌陷”。由于流动相中有机溶剂比例太少，高键合覆盖率、“完全封端”的C18没有很好的被流动相浸润，这会使得流动相和固定相没有很好的接触，造成键合相卷曲，固定相之间相互吸附，从而导致固定相可以和样品相互作用的表面积减少，使得保留时间逐渐变短。这时候立即用一定量的有机溶剂（建议40%乙腈水）冲洗色谱柱可以使键合相恢复，这种现象在短链烷烃结合，未封尾的反相键合相上则很少发生或者是不发生。

（内容来源仪器信息网）