水产品兽药残留检测方法及能力验证详细说明

一、水产品兽药残留检测方法

兽药残留（animal drug residues）是指给动物使用药物后蓄积或贮存在细胞、组织或器官内的药物原形、代谢产物和药物杂质。近10年来，水产品中兽药残留问题引起了社会的广泛关注，也经历了贸易壁垒的多发期，直接影响着中国水产行业的转型和升级。在水产品养殖过程中，非法使用违禁药物、不遵守休药期、生物体代谢差异和不合理用药等都有可能导致兽药残留超标。

兽药残留分析的检测手段多样，酶联免疫试剂盒、胶体金免疫试纸条和荧光试纸条等快速检测产品能够实现高通量、快速筛选，其灵敏度、准确性和时效性正在不断优化和革新；气相色谱仪、液相色谱仪、气相色谱-质谱仪、液相色谱-串联质谱仪和高分辨质谱等仪器是实验室常用的分析设备，具有定量准确、准确度更高等优点，特别是具有高灵敏度、高分辨率的质谱仪，是进行阳性样品确证分析的首选。

1、硝基呋喃类代谢物检测方法

硝基呋喃类药物是一类化学合成的广谱抗菌药物，常见的有呋喃唑酮(furazolidone，FZD)、呋喃西林(nitrofurazone，NFZ)、呋喃妥因(nitrofurantion，NFT)和呋喃它酮(furaltadone，FTD)，曾广泛用于畜禽、水产等动物传染病的预防与治疗。硝基呋喃类药物原药及其代谢产物具有一定的毒性，有致畸、致突变和致癌的危险。出于安全性考虑，自1993年开始，欧盟、美国等发达国家和地区先后颁布了禁止使用该类兽药的禁令。中国于2002年颁布的农业部第193号公告《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》，明确禁止使用硝基呋喃类广谱抗菌药物。但是由于硝基呋喃类药物价格低廉、疗效好，在水产养殖中仍存在违禁使用的现象，在近几年开展的水产品风险隐患排查工作中屡有检出。

硝基呋喃类药物在生物体内代谢迅速，很难检测到原药，因此标准方法都是对其代谢产物进行测定，表1中列出了当前适用于水产品中硝基呋喃代谢物残留测定的方法标准，均采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)进行测定，其中农业部783号公告-1-2006是中国水产品质量安全监控的推荐方法，该方法的适用范围广、定量准确、灵敏度高，是常用的检测方法。

表1 水产品中硝基呋喃代谢物残留测定方法标准

2、孔雀石绿检测方法

孔雀石绿（malachite green, MG）作为一种三苯甲烷类染料，曾广泛用作水产养殖业中的驱虫剂和杀菌剂，以防治鱼类水霉病、鳃霉病、及小瓜虫病等，是一类抗菌效力较强的药用染料。然而，MG不仅在生物体内有明显蓄积现象，且迅速被代谢成隐色孔雀石绿(leucomalachite green, LMG)。在鱼体内和环境中残留时间长，具有潜在的“三致”作用，因此包括中国在内的许多国家都禁止其在水产养殖中使用。但是由于MG抗菌效果较好，价格低廉且无有效替代药物等原因，在近几年的监控工作中发现MG仍在个别水产品种的养殖中违规使用。

表2是水产品中MG残留测定常用的方法标准，GB/T 19857—2005 (第一法）和GB/T 20361—2006的检测结果相近，差异不显著，可根据实验室情况自行选择。但是与液相色谱法（LC）相比，LC-MS/MS前处理操作相对简单，定性方式更准确，是进行阳性样品确证的必要方法，也是农业部水产品质量安全监控的首选方法。

表2 水产品中孔雀石绿残留标准测定方法

3、 氯霉素检测方法

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是1947年首次从委内瑞拉链丝菌的培养液中提取而得到的抗生素，具有广谱抗菌作用，对多数G+、G-菌均有效，在水产养殖中能有效防治烂鳃、赤皮病。CAP对人类的毒性较大，可抑制骨髓造血机能、造成过敏反应，引起不可逆的再生性障碍贫血等。

美国、日本、韩国和欧盟等国家和地区均已禁止在食用性动物中使用氯霉素，并规定在动物源性食品中不得检出。中国农业部在2002年12月第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定CAP为禁用药物，在动物性食品中不得检出［6］。目前，CAP是中国水产品质量安全监管的对象之一，其抑菌效果优于其替代药物，近年来在大宗水产品中的检出率不高，但是带入途径复杂，仍是目前监控的重点。

水产品中CAP残留量的测定方法很多，包括酶标法、气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）和LC-MS/MS等（表3）。其中酶标法用于CAP的快速筛查测定，气相色谱法可以用于CAP的准确定量测定， LC-MS/MS和GC-MS法均可以作为CAP残留的确证方法，在对阳性样品的测定中，可以互为补充。

表3 水产品中氯霉素残留标准测定方法

4、磺胺类

磺胺类药物（sulfonamides, SAs）是对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，主要用于预防和治疗细菌感染性疾病。在水产养殖中主要用于治疗鱼、虾、蟹、鳖等动物的细菌性疾病，防治鲤的赤鳍病，香鱼、虹鳟等的弧菌病等。由于SAs在生物体内的作用时间和代谢时间较长，蓄积浓度超过一定值会对人体健康造成危害，导致很多细菌对SAs产生抗药性［1］。

因此，许多国家都对SAs的使用限量进行了规定，欧盟规定肉类食品中磺胺类药物的最高残留限量(MRL)为：单一SAs药物≤25 μg/kg，SAs总量≤100 μg/kg；日本肯定列表规定动物源性食品中单一SAs0.01~0.1 mg/kg，其中水产品为0.1 mg/kg；国际食品法典委员会与中国农业部235号公告中均规定动物组织中SAs药物的MRL为100 μg/kg。

表4是水产品中磺胺类药物残留测定的方法标准，其中农业部958号公告-12-2007和农业部1077号公告-1-2008是常用的检测方法，农业部958号公告-12-2007前处理繁琐，回收率稍低，灵敏度基本能够满足限量要求；农业部1077号公告-1-2008方法简便快捷，灵敏度高，可以用于磺胺类药物的阳性确证。

表4 水产品中磺胺类残留标准测定方法

二、水产品兽药残留检测能力验证

    能力验证(proficiencytesting)也称能力验证计划，是通过实验室间测试结果的比对来判定实验室能力的合格评定活动。近年来，农业部组织开展了水产品中药物残留、重金属及贝类毒素等3大方面检测能力验证，涉及的能力验证考核参数包括氯霉素、孔雀石绿、镉、铅、麻痹性贝类毒素等20多项，有力地促进了质检机构的运行和管理，提升了检测人员的技术水平。

目前，兽药残留测定是进行水产品质量安全监控的主要手段，氯霉素、孔雀石绿和硝基呋喃等禁用药物是药物残留监控的重点，为了确保水产品的质量安全，氟甲砜霉素、甲砜霉素、磺胺类和喹诺酮类等限用药物也早已纳入监控工作。但是由于各个实验室间的检验能力良莠不齐，有时会对检验数据的可靠性存在质疑，影响了监控工作的权威性，因此监管部门将能力验证作为检验实验室能力水平的一个主要的方式。

能力验证（proficiency testing）是通过实验室间比对，按照预先制定的准则来判定实验室能力的活动。能力验证是实验室认可机构加入和维持国际相互承认协议（mutual recognition agreement, MRA）的必要条件之一，也是实验室进行自我评价的手段［2］。中国农产品能力验证考核始于2003年，虽然起步较晚，但是实验室能力验证的方法标准均参考国外权威机构的标准制定，10多年来技术能力取得了长足的进步。能力验证在检测实验室的覆盖率逐年增加，监管部门通过组织能力验证，可以了解实验室是否有能力胜任所从事的监控工作；实验室通过参加能力验证，了解自身能力，将其作为内部质量控制的补充措施，满足持续改进的要求。

根据能力验证活动的要求，选择正确的检测方法标准，掌握检测方法的操作要领和关键点，减少方法对检测结果的影响是确保顺利通过能力验证工作的关键。在此基础上，还建议采取做好准备工作，提高检测能力，保证质量控制措施到位，以及对检测数据进行正确的修约等如下保障措施，减少不满意结果的产生。

对做好水产品兽药残留检测技术能力验证工作，特提出以下建议：

1、提前练习

按规定的标准操作程序或作业指导书进行操作，熟练掌握方法的前处理过程，并能重现方法的灵敏度和准确度。

2、 标准溶液核查

根据标准要求重新配置标准贮备液或购置有证标准溶液，并与在用标准溶液进行核对，保证标准溶液的有效性。

3、 考核样品的处理

检查编号是否准确，包装是否完整、无破损，按照通知要求进行保存。严禁用微波等加热方式对样品解冻，应在室温下自然解冻后再进行前处理。样品前处理过程中，应尽量避光操作。

4、做好质量控制

质量控制中应包括空白实验(包括试剂空白和对应的基质空白)和控制样品（检出限加标、3~10倍检出限加标），与考核样品同时测定。空白实验可确保空白值在控制限内，避免测试过程中的污染和空白基质中的干扰。控制样品的有效性可确保测试结果的灵敏度和准确度。

5、 检测结果的判断

在进行检测结果计算时，首先应考察校准曲线是否满足要求，其次是平行样的测定结果是否在相对偏差范围内，然后是质控样品的准确度和灵敏度是否符合标准要求，还要进行不确定度的计算。对于偏差较大的数据，可以采用统计学方法进行测算，如平均值的置信区间等。

（内容参考食典报）